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    ：针对特定目的核酸片段的测序，首先要对目的测序区域进行PCR扩增；而针对碎片化DNA的测序，则要将碎片化的DN**段通过克隆的方式连接到质粒载体中；对于部分PCR产物的测序也可以对其进行克隆，以保证测序样品的纯度和浓度。：向得到的待测样品中分别加入4种dNTP和4种ddNTP，从而得到不同位置匹配终止的序列。ddNTP循环测序4.凝胶电泳获得序列：对得到的序列进行凝胶电泳，根据碱基的顺序和位置确定序列信息。电泳确定序列***代测序技术的优势和劣势优势：***代测序技术的准确性远高于二、三代测序，因此被称为测序行业的“金标准”；***代测序每个反应可以得到700-1000bp的序列，序列长度高于二代测序；***代测序价格低廉，设备运行时间短，适用于低通量的快速研究项目。劣势：***代测序技术一个反应只能得到一条序列，因此测序通量很低；***代测序技术虽然单个反应价格低廉，但是获得大量序列的成本很高。***代测序技术的应用PCR产物测序：对目的基因的PCR产物进行测序，得到目的基因序列；重测序：突变，安徽专注迈杰转化医学NGS平台服务至上、SNPs、插入或缺失克隆产物的验证；分型分析：微生物和***分类学鉴定，安徽专注迈杰转化医学NGS平台服务至上、HLA分型、病毒分型等；临床应用：**突变基因的检测和**个体化***，安徽专注迈杰转化医学NGS平台服务至上。 迈杰转化医学拥有丰富的伴随诊断开发经验，高质量的管理体系和高素质的研发团队。安徽专注迈杰转化医学NGS平台服务至上

    甲基化分析PacBio测序的技术原理可以直接检测到发生甲基化的核苷酸，因此可以在进行其它测序分析的同时完成DNA甲基化的分析。Nanopore技术测序原理将在某一面上含有一对电极的特殊脂质双分子层置于一个微孔之上，该双分子层中含有很多由α溶血素蛋白组成的纳米孔，并且每个纳米孔会结合一个核酸外切酶。当DNA模板进入孔道时，孔道中的核酸外切酶会“抓住”DNA分子，顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基，每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断，根据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类，**终得出DNA分子的序列。Nanopore技术的优缺点Nanopore技术的优点：可以检测结构变异和可变剪切；能直接对RNA分子进行测序；能对修饰过的碱基进行测序；测序读长更长，可以达到150kb；测序数据可以做到实时监控；运行速度快。Nanopore技术的缺点：采用的是水解测序法，不能进行重复测序，因而无法达到一个满意的测序精确度。Nanopore技术的应用基因组组装利用其测序长的特点，可以填补基因组中大片段的gap。临床应用对于临床实践，实时获取和分析DNA/RNA序列是一件很重要的事情，对于传统的高通量测序，做到这一点非常困难，但对于Nanopore技术平台，实现实时获取序列相对容易。 北京专注迈杰转化医学NGS平台推荐咨询迈杰转化医学拥有3D HISTECH Pannoramic MIDI数字化病理扫描仪及91360远程病理系统。

    ⑦侧翼序列碱基数，各部分之间用tab键隔开。按照这种格式依次对68个基因座进行录入。68个基因座基因配置文件录入完成后，运行***。该文件给出了①基因座名称，②基因分型，③扩增子碱基数，④扩增子序列信息，⑤测序深度五个部分。根据国际法医遗传学会(internationalsocietyforforensicgenetics，isfg)发表的关于y-str基因座的str序列指南()和niststr数据库(strbase.)y染色体str情况说明对67个y-str基因座的序列构建**重复结构。实验结果见表3。结果表明，标准品2800m得到了完整的str分型，完全能够满足法医str检验的要求。表3-1注：n与其后数字表示一段碱基序列，其后数字表示序列的碱基数目。表3-2注：n与其后数字表示一段碱基序列，其后数字表示序列的碱基数目。二、采用实施例1制备的试剂盒的应用——口腔拭子样本的基因座分型样本一、样本二和样本三为3名汉族男性无关个体的口腔拭子的基因组dna，浓度均为1ng/μl。3名汉族男性均知情同意。将步骤一中的标准品2800m水溶液替换为样本一、样本二或样本三，其它步骤均不变。检测结果见表3。结果表明，样本一、样本二和样本三均获得了完整的str分型结果。

    1、Illumina原理：桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像主要步骤：①DNA文库制备——超声打断加接头②Flowcell——吸附流动DN**段③桥式PCR扩增与变性——放大信号④测序——测序碱基转化为光学信号优势劣势：Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换。而读长短（200bp-500bp）也让其应用有所局限。2、Roche454油包水PCR+4种dNTP车轮大战+检测焦磷酸水解发光主要步骤：①DNA文库制备——喷雾打断加接头②乳液PCR——注水入油**PCR③焦磷酸测序——磁珠入孔，焦磷酸信号转化为光学信号优势劣势：454技术优势测序读长较长，平均可达400bp，缺点是无法准确测量类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，可能导致结果不准确。也正是由于这一原因，454技术会在测序过程中引入插入和缺失的测序错误。3、IonTorrent原理油包水PCR+4种dNTP车轮大战+微电极PH检测主要步骤：①DNA文库制备——喷雾打断加接头②乳液PCR——注水入油**PCR③微电极pH检测——磁珠入池记录pH优势劣势：IonTorrent与454相比，主要差异在测序中，IonTorrent不需要昂贵的物理成像设备，成本相对较低体积较小。迈杰转化医学可以提供覆盖肺ai、肠ai、肝ai、胃ai、乳腺ai、前列腺ai等多种实体瘤的上百项检测项目。

    包括67个y-str基因座和1个性别决定基因座amelogenin)。相比于illumina公司的forenseqtmdnasignatureprepkit，本发明提供的试剂盒中包含41个新的y-str基因座，能提供更多新的遗传信息。而且本发明提供的复合扩增体系中所有y-str基因座的**大扩增子长度都小于300bp，而forenseqtmdnasignatureprepkit中有约％(7/24)基因座的**大扩增子长度大于300bp，不利于降解检材的分析。本发明提供的试剂盒是本发明的发明人经过大量实验摸索获得的，试剂盒中的引物具有不可替换性；即引物被替换后，部分基因座将会被抑制且抑制效果不可预知。实验证明，采用本发明提供的试剂盒检测标准品2800m中68个基因座的str分型，分型结果准确。本发明具有重要的应用价值。附图说明图1为67个y-str基因座的pcr扩增产物的长度范围分布。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。标准品2800m为promega公司的产品，产品目录号为dd7251。 迈杰转化医学提供完整的多平台多组学服务，打造流程化yao企业合作。湖南多基因联合检测迈杰转化医学NGS平台来电咨询

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    ***代测序技术1975年由FrederickSanger所提出的链终止法以及1977年由WalterGibert所发明的链降解法被称为***代测序技术。1977年，WalterGilbert和FrederickSanger发明了***台测序仪，并应用其测定了***个基因组序列，噬菌体X174，全长5375个碱基。WalterGilbert和FrederickSanger也因在测序技术中的贡献获得了1980年诺贝尔化学奖。技术原理目前，基于***代测序技术的测序仪几乎都是采用Sanger提出的链终止法。链终止法测序的**原理是ddNTP的2'和3'端都不含羟基，因此在合成核酸链的过程中无法形成磷酸二酯键，从而导致DNA合成反应中断。在测定待测核酸片段的序列时，向反应体系中加入一定比例的带有放射性同位素标记的4种ddNTP，利用DNA聚合酶来延伸结合在待测核酸模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止，**终会得到一组长度各相差一个碱基的链终止产物，这些产物可通过高分辨率变性凝胶电泳分离并根据其长度排序，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影进行检测，从而确定目的核酸片段各个位置的碱基。完整的测序过程分为4步：：如要利用Sanger测序方法进行完整基因组的测定，首先要将提取得到的样品完整DNA打碎，形成DN**段，如只是测定单个目的基因的序列。 安徽专注迈杰转化医学NGS平台服务至上

公司拥有国际前列的产品开发团队及完善的产品研发流程，与全球药企展开伴随诊断产品的开发合作，目前，公司已有多个诊断产品上市，另有数个伴随诊断产品已进入临床试验或申报阶段。

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